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ELISPOT檢測的質量控制

作者:admin 信息來源:達科為 日期:20130829 打印 字體:  
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一、ELISPOT質量控制簡介
      一般來說,ELISPOT檢測只要做到標準化就可以滿足要求。但是,有些實驗對ELISPOT檢測數據的可信度有更高要求,比如疫苗的臨床研究和某些疾病治療對免疫系統影響的評估等,需要ELISPOT檢測的質量控制。
ELISPOT質量控制是控制ELISPOT檢測的質量(結果的準確性、重復性、可信度等)。如:工廠做生產出產品,工廠的質控是控制產品的質量;實驗室做檢測出數據,實驗室的質控是控制檢測數據的質量即準確性。

      那么如何能控制ELISPOT檢測的質量呢?如果有一種細胞和一種刺激物,并且ELISPOT斑點頻率是已知的話,那么就有了一個ELISPOT的標準系統。每次其它樣品檢測時,只要帶上這個系統,實驗者就可以用標準系統來質控待測樣品的ELISPOT檢測。這也是所有其它檢測質控的基本原理。

      現在的關鍵是找到這樣一種細胞和一種刺激物,每次都能做出完全相同的ELISPOT結果。


二、標準細胞必須采用凍存細胞庫

     首要問題是細胞。我們知道,細胞是有生命的,不像無生命的物質那樣容易保存。那么能不能采用新鮮細胞呢,比如每次都從同一個志愿者身上采集?不能。因為志愿者的健康狀態和免疫狀態都是動態的,雖說采自同一個人,但是細胞免疫水平可能會有變化,ELISPOT結果無法完全重復。那么能不能采集細胞之后長期飼養呢?不能。且不說長期培養成本高且周期長,細胞本身的免疫水平和克隆數目都會隨著培養和傳代而發生變化。

      能滿足ELISPOT檢測長期不變化的只能是凍存細胞庫。一次采集大量細胞凍存在-197°C的液氮環境中,細胞的斑點頻率可以在數年之內恒定不變。PBMC分離和凍存復蘇的方法參見本網站內容。


三、標準刺激物選用CEF或者ICE

     那么,刺激物選擇什么呢?非特異性的刺激物很便宜,但是不能用于質控。三個原因阻礙了這一點。

    其一、非特異性的刺激物刺激效果不穩定。如圖9.2所示,非特異性的刺激物(有絲分裂原Mitogen)的刺激曲線幾乎沒有平坦的部分。也就是說,刺激物的濃度有細微變化,馬上就會體現在刺激斑點數目的變化上了,這樣實驗結果很難完全重現。相反,抗原的刺激曲線非常平坦,只要達到有效刺激濃度,斑點頻率就不再變化。


     其二,非特異性刺激物的刺激原理與特異性的刺激物刺激原理不同。一般來說,質控系統和被質控的體系之間越相近越好:經過相同的處理,接受相同的影響因素,發生相同的物理、化學、生物過程。但是非特異性刺激物刺激是單細胞過程,與抗原經APC呈遞而刺激T細胞是完全不同的過程。所以用非特異性刺激反應質控與特異性刺激反應質控,從原理上也說不同。

     其三,非特異性刺激物多數是蛋白質,比如PHA與ConA,效價不穩定,容易失活,不易保存。相對而言,作為抗原的蛋白和多肽,免疫原性和刺激效果要穩定得多。

      綜上所述,在質控系統中,標準刺激物宜選用抗原。抗原中,以T細胞表位肽組成簡單,機理清楚,結果穩定,所以是首選。再則考慮到標準刺激物對健康人的T細胞也應該能刺激作用,所以國際上選定三種常見病毒CMV、EBV、Flu Viurs,把它們的32條T細胞表位肽集中起來,作為ELISPOT標準樣性刺激物CEF。另有簡化版的23條肽肽庫ICE(貨號CT370),更加實用。 


 四、實驗室內部質控與實驗室之間的質控以及國家質控體系

      以上介紹了ELISPOT質控系統的原理與組成。現在來介紹一下質控系統的應用范圍。根據質控系統的應用范圍,可以分為以下三個層次。

     基本的層次是實驗室內部質控系統。比如一個實驗室有好幾組實驗人員,會在很長的時間內(一年或數年)做高質量的ELISPOT檢測。這就需要用到實驗室內部的質控系統。因為實驗室內部的條件相對穩定,管理相對統一,實驗室內部質控系統的技術目前已經非常成熟。達科為公司有整套建立實驗室內部ELISPOT質控系統的方案,已經幫國內數家實驗室建立了這一系統。實踐也證明了該系統有效可行,指控效果非常明顯。

     第二個層次是實驗室之間的質控系統。當今的科研有合縱連橫的趨勢,一些重大的科研項目或者疫苗的臨床評估往往是跨實驗室、跨地域甚至跨國家的聯合項目。為了使這些分布在不同地區不同時間的ELISPOT檢測有相同的標準和可信度,必須采用實驗室之間的質控系統。就我們達科為公司與國內十余家實驗室聯合作的評估而言,實驗室之間的質控存在唯一的一個非技術障礙,那就是凍存質控細胞的運輸問題。

     凍存細胞更好能通過液氮運輸,如果采用小型背負式液氮罐,實驗者可以在同一城市的不同實驗室之間運輸凍存細胞,但是對于跨城市或者跨國家的長途運輸就不太可能了。液氮罐上飛機或者火車都是非法的。如果采用干冰運輸,凍存細胞的狀態和存活率就會打折扣。我們的研究表明,經過干冰運輸的細胞,存活率只有80%左右。并且干冰運輸的可靠性也不能完全得到保證,一旦干冰耗盡或者細胞未完全被干冰包裹,細胞的存活率就會直線下降,甚至完全死亡。

     第三個層次是國家質控系統。任何成熟的檢測技術都會有相應過國家標準和質控系統。但是由于ELISPOT技術還在發展中,目前世界上還沒有任何一個國家建立了ELISPOT技術的國家標準和質控系統。美國是該項工作開展得比較早的國家,目前仍然在不同實驗室之間作驗證工作,研究建立質控系統的可行性。

     達科為公司于2005年底與我國國家職能部門,國家食品藥品監督管理局下設的中國生物制品檢定所開展了合作研究。05-06年的研究選定了北京、上海、天津、深圳的11家實驗室,凍存細胞在城市內采用了液氮運輸的方式,城市間采用了干冰快遞的方式。

    如表9.1所示,這是我們一次實驗的結果。可以看到,前三個實驗室的結果重復性很好,但是第四個實驗室的結果明顯偏小。


      后面經過仔細排查與驗證,是第四家實驗室的血球計數板嚴重不準導致的實驗誤差。
     綜上所述,ELISPOT檢測是實驗室內部質控系統已經成熟;實驗室之間的質控系統需要解決凍存細胞的運輸問題;而國家質控系統尚在前期驗證、摸索階段。

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