您好,歡迎光臨達科為生物城!
免費熱線電話 : 400 819 7199 收藏達科為生物城
當前位置: 首頁 > 技術天地 > 技術專欄 > 表觀遺傳 > 正文

ChIP實驗Tips匯總(上),來自英國ChIP實驗專家Chromatrap?的分享

作者:admin 信息來源:達科為 日期:20190614 打印 字體:  
分享到:

ChIP是一種發展很快的研究技術,主要應用于確定細胞內DNA與蛋白質的相互作用,這一點對正確的基因調控尤為重要。ChIP在表觀遺傳學領域正被逐漸應用于藥物研發中的分子機制研究、分層醫學、診斷學以及將ChIP與第二代測序相結合的ChIP-seq技術中。

 

然而ChIP實驗難度大,通常會遇到這樣或那樣的問題:如何確保較好的染色質質量、如何選擇合適的片段化方式、超聲處理和酶解方法有哪些優缺點、染色質片段化大小哪個范圍合適、抗體的選擇和設置又有哪些注意的地方?

 

當您在為遇到上述的問題食不知味、夜不能寐、山重水復疑無路時,不妨看看英國ChIP實驗專家Chromatrap?提供的Top 10 tips錦囊,或許能柳暗花明又一村!

 


Tip①  在ChIP實驗中,染色質的質量是 重要的一方面,低質量的染色質往往導致不如人意的結果。

一個成功的ChIP實驗很大程度上依賴于所制備的染色質的質量。染色質制備 重要的三個方面包括:裂解、交聯、片段化。每一個步驟都應該被獨立地優化以合適地還原所研究的生物過程。請閱讀以下在染色質制備中的相關技巧。

 

Tip②  實驗過程中始終保持染色質在冰上的狀態。

染色質在室溫保存或處理時極易被降解,且速度非常快。為了防止染色質的快速降解以及獲得具有良好可重復性的結果,保證在整個實驗過程中染色質一直處于冰上。盡量避免反復凍融,制備完成后獨立分裝到小管中保存,可以幫助防止染色質的降解。在Chromatrap?提供的試劑盒中,每個IP所需要的染色質是極小量的,因此每一個獨立分裝的小管樣品可以提供多次ChIP實驗所需的染色質量。

 

Tip③  避免過度交聯細胞,這會導致細胞耐受后續的裂解和片段化。

正如上述提到的,染色質的質量在得到一個好的ChIP結果中起著關鍵性作用。為了保證較好的染色質的質量,細胞的交聯條件需要被不斷優化。避免過度交聯細胞這一點尤為重要,因為這會導致細胞耐受后續的裂解和超聲片段化。過度交聯細胞也會影響反交聯的效率(即交聯效果不能被有效地去除),這會影響后續的實驗過程(例如qPCR)。

 

Chromatrap?推薦使用1%的甲醛于培養基或PBS中交聯細胞,在室溫條件下于旋轉混勻器上交聯10分鐘即可。如果效果依舊不佳,可嘗試將交聯時間減少至5分鐘。

 

Tip④  確保交聯過程中使用的溶液現配現用。

交聯細胞這一過程會影響所制備的染色質的質量從而影響整個ChIP實驗。確保每次制備染色體的過程中使用的甲醛都是現配現用的,這也可以保證實驗結果具有更好的可重復性。確保甲醛中沒有甲醇的污染,因為甲醇可以破壞細胞膜從而改變交聯條件。

 

Tip⑤  根據細胞類型選擇合適的片段化方式:超聲處理或者酶解。有些細胞可以耐受酶解,因此需要選擇超聲裂解的方式。

染色質可以通過超聲處理(超聲波機械斷裂)或者酶解(微球菌核酸酶消化)的方式片段化。根據細胞的不同選擇合適的片段化方式是十分重要的。Chromatrap?可以依據片段化方法的不同提供相應的試劑盒。我們也可以提供酶解片段化的優化試劑盒。

 

在無法使用超聲處理或者為了盡可能減少對可被特異抗體識別的蛋白抗原表位的破壞的情況下,酶解片段化方法十分有效。然而,這種方法具有一定的偏好性,因為核酸酶具有切割特定基因序列的特性。酶解片段化主要應用于非交聯染色質免疫沉淀(Native ChIP)實驗,在這個過程中,染色質與蛋白質并沒有被交聯,這時如果采用超聲處理來片段化染色質將破壞染色質與蛋白質相互作用形成的復合物。一些細胞種類也許耐受裂解從而導致較差的酶解片段化效率,在這種情況下可以嘗試超聲處理來同時幫助細胞的裂解以及染色質的片段化。

 

以下列出了超聲處理以及酶解片段化的優缺點,供您優化片段化過程中參考從而提高效率。

 

處理方式

優點

缺點

超聲處理

隨機片段化染色質;適合于較難裂解的細胞類型

 

在乳化作用或者過熱的環境中具有破壞目的蛋白抗原表位的潛在可能;需要較昂貴的儀器設備;不能應用于非交聯染色質免疫沉淀(Native ChIP)實驗 

酶解

更溫和的處理方式減少了對目的蛋白抗原表位的破壞;不需要任何昂貴的儀器設備于非交聯染色質的制備 

在片段化的過程中,由于微球菌核酸酶對基因序列的選擇性從而具有一定的序列偏好性;不適用于一些較難裂解的細胞類型


Chromatrap?產品信息:

貨號

產品

規格

分類

500189

ChIP-seq 24 spin columns ,Pro A, with Premium control antibodies

24

ChIP-seq

超聲處理

500190

ChIP-seq 24 spin columns ,Pro G, with Premium control antibodies

24

ChIP-seq

超聲處理

500191

ChIP-seq Enzymatic 24 spin columns ,Pro A, with Premium control antibodies

24

ChIP-seq

酶解

500192

ChIP-seq Enzymatic 24 spin columns ,Pro G, with Premium control antibodies

24

ChIP-seq

酶解

500115

QPCR Premium Chromatrap Pro-A spin column kit, 24 columns (includes control antibodies and primers)

24

ChIP-qPCR、

超聲處理

500116

QPCR Premium Chromatrap Pro-G spin column kit, 24 coloumns (includes control antibodies and primers)

24

ChIP-qPCR、

超聲處理

500167

QPCR Enzymatic Premium Chromatrap Pro-A spin column kit, 24 columns (includes control antibodies and primers)

24

ChIP-qPCR、

酶解

500169

QPCR Enzymatic Premium Chromatrap Pro-G spin column kit, 24 coloumns (includes control antibodies and primers)

24

ChIP-qPCR、

酶解


Chromatrap?為英國Porvair Science公司與斯旺西大學合作開發的產品。該品牌產品主要為ChIP相關試劑盒。Chromatrap? ChIP 測定技術比傳統磁珠法的效率更高,原因是與蛋白質 A 或 G結合的固相多孔聚合物捕獲染色質的效率更高,無須擔心清洗過程中會意外丟失珠子。Chromatrap?技術獲得的DNA Pull down 水平要比傳統方法高出25倍,尤其適合于小型或低豐度生物樣品。


微博名稱:達科為生物城
微博地址:
http://e.weibo.com/bjdakewe

微信二維碼:
達科為生物技術集團  京ICP備13014125號-1
全國免費熱線:400 819 7199 Email:[email protected]
聯系我們
© Copyright 2013 Hewlett-Packard Development Company, L.P. All Rights
福建时时彩下载手机版 太仓1号股票配资网 11选5全包盈利技巧 河南体彩11选五走势图 广西体彩十一选五前三 新上市的股票查询 广西快3专家推荐号码 中国股票涨跌幅限制 贵州省快3走势图 秒速赛车计划网址 一起配资网